蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，通過(guò)超微量分光光度計(jì)的比色法測(cè)定基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸、絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。
比色法一般有bca，bradford，lowry幾種：
★lowry法
以早期的biuret反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與cu2反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與biuret相比，lowry法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑；反應(yīng)需要的時(shí)間較長(zhǎng)；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響；含edta，tritonx-100，ammoniasulfate等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。
★bca法
一種較新的、更敏感的蛋白測(cè)試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與cu2反應(yīng)產(chǎn)生cu，后者與bca形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長(zhǎng)。此化合物與蛋白濃度的線(xiàn)性關(guān)系強(qiáng)，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對(duì)于lowry法，操作簡(jiǎn)單，敏感度高。但與lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。
★bradford法
這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其特點(diǎn)是敏感度好，是lowry和bca兩種測(cè)試方法的2倍；操作更簡(jiǎn)單，速度更快；只需要一種反應(yīng)試劑；化合物可以穩(wěn)定1小時(shí)，方便結(jié)果；而且與一系列干擾lowry，bca反應(yīng)的還原劑（如dtt，巰基乙醇）相容。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的。主要缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無(wú)可比性。
以上幾種方法到底該相信哪種？
由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一，所以同時(shí)使用幾種方法對(duì)同一樣品得出的樣品濃度無(wú)可比性。即使測(cè)定同一樣品，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，測(cè)試后的濃度也不一致。因此在選擇比色法之前，是參照要測(cè)試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類(lèi)似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問(wèn)題是樣品的吸光值太低，導(dǎo)致測(cè)出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。關(guān)鍵問(wèn)題是，反應(yīng)后超微量分光光度計(jì)的重要配件-比色杯的顏色有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測(cè)試時(shí)間，所有的樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)樣品），都必須在此時(shí)間內(nèi)測(cè)試。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應(yīng)溫度、溶液ph值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因。此外，非常重要的是，用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確。
實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長(zhǎng)密度和生長(zhǎng)期，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測(cè)推斷細(xì)菌的生長(zhǎng)密度。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要采用超微量分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度。od600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對(duì)每種微生物和每臺(tái)儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，做出校正曲線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)中偶爾會(huì)出現(xiàn)菌液的od值出現(xiàn)負(fù)值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時(shí)間后，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng)。另外，需注意的是，測(cè)試的樣品不能離心，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài)。
